Phương pháp PCR là gì?

Tên khác:
Phương pháp khuếch đại đoạn DNA

PCR  là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là một bản sao duy nhất.

Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự. PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các mẫu DNA nhỏ.

Phương pháp PCR này được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

Thành phần tạo nên PCR

Năm thành phần cốt lõi được yêu cầu để thiết lập một PCR gồm:

  • Mẫu DNA cần được sao chép.

  • Đoạn DNA ngắn bắt đầu phản ứng PCR, được thiết kế để liên kết với hai bên của phần DNA mà bạn muốn sao chép.

  • 4 loại nucleotide DNA (còn được gọi là dNTPs) tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1).

  • DNA polymerase chịu nhiệt enzyme : phải là men polymerase chịu được nhiệt độ. Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase. Đây là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus.

  • Các loại muối cần thiết để tạo ra một môi trường thích hợp cho enzyme hoạt động. thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 2 1.5mM.

Nguyên tắc hoạt động của PCR

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt,nghĩa là các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA mẫu và DNA polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân.

Quy trình của PCR

Một quá trình pcr được thực hiện thông qua 3 bước chính là biến tính, ủ và mở rộng. Ba giai đoạn này được lặp lại 20-40 lần, gấp đôi số lượng bản sao DNA mỗi lần.

Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép của DNA biến tính tách ra ở nhiệt độ cao. Ở bước thứ hai, nhiệt độ được hạ xuống và hai sợi DNA trở thành khuôn cho DNA polymerase tổng hợp đoạn DNA đích. Khả năng khuếch đại chọn lọc là do việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn ADN đích khuếch đại dưới những chu trình nhiệt đặc hiệu. Và quá trình đó được mô phỏng chi tiết dưới đây

Giai đoạn biến tính

  • Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi khác được đun nóng đến 94-95⁰C.
  • Đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ
  • Nhiệt độ cao gây ra liên kết hydro giữa các bazơ trong hai dải DNA mẫu để phá vỡ và hai sợi tách rời. Điều này dẫn đến hai chuỗi DNA đơn lẻ, sẽ hoạt động như các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới.
  • Điều quan trọng là nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng các sợi DNA đã tách hoàn toàn.
  • Điều này thường mất từ ​​15-30 giây.

Giai đoạn ủ

  • Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA.
  • Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên mỗi đầu của chuỗi được sao chép.
  • Đoạn mồi  được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme polymerase chỉ có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép. Chỉ một khi đoạn mồi được kế nối thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu.
  • Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược.
  • Bước này thường mất khoảng 10-30 giây.

Giai đoạn mở rộng

  • Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72⁰C để cho phép DNA mới được tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base DNA.
  • Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu. Một enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau. Enzyme này thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa nhiệt gọi là Thermus aquaticus.
  • Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu).
  • Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu.

Ứng dụng của PCR

Chỉ cần nhìn vào ảnh thì bạn đã hình dung ra được phần nào các ứng dụng của phương pháp PCR này. Bây giờ chúng ta sẽ cùng đi chi tiết hơn từng ứng dụng để thấy được tầm quan trọng của phương pháp này.

  • Kiểm tra huyết thống

Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.

  • Vân tay di truyền

Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có. Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ.

  • Chẩn đoán bệnh di truyền

Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng phương pháp PCR. Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến.

Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông qua khuếch đại của DNA của virus. Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng, có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra.

  • Tách dòng gen

Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản toàn bộ một sinh vật-mô tả quá trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác. PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vào một vector (vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid (một phân tử DNA vòng). Thể hiện một gen nhân bản cũng có thể là một cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men.

  • Phân tích mẫu DNA cổ

Sử dụng PCR nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi.

Người đăng: hoy
Time: 2020-10-15 14:21:40